همسانه سازی سازه خاموشی ژن salutaridinol – 7 – o – acetyltransferase به روش rnai و انتقال آن به گیاه دارویی شقایق

شقایق (papaver somniferum l.) یکی از قدیمی ترین و مهم ترین گیاهان دارویی است که اهمیت آن بواسطه بیوسنتز و ذخیره آلکالوئیدهای بنزیل ایزوکوئینولی می باشد. در مهندسی متابولیت این گیاه آنزیم های کلیدی مسیر متابولیکی آلکالوئیدها مورد دستورزی ژنتیکی قرار می گیرند. سالوتاریدینول 7 - اُ - استیل ترانسفراز (sat) آنزیم مرکزی در مسیر بیوسنتز مرفینان ها است. این آنزیم تبدیل آلکالوئید سالوتاردینول به سالوتاردینول - 7 – اُ - استات که پیش ماده اولیه تبائین در مسیر بیوسنتزی مرفینان ها به شمار می آید را عهده دار می باشد. در این مطالعه جداسازی و شناسایی ژن sat با استفاده از آغازگرهای مربوطه صورت گرفت و پس از همسانه سازی در ناقل، توالی یابی گردید و از توالی ژنی بدست آمده برای ساخت سازه خاموشی استفاده شد. قطعات سنس و آنتی سنس به ترتیب و طی دو مرحله هضم آنزیمی در حامل خاموشی pgsa1285 همسانه سازی شدند. همسانه سازی در جهت سنس و آنتی سنس با استفاده از pcr، هضم آنزیمی و توالی یابی مورد تایید قرار گرفت. به منظور انتقال سازه ساخته شده به گیاه و همچنین بهینه سازی انتقال ژن به گیاه سه آزمایش مجزا روی سه نوع ریز نمونه هیپوکوتیل، کوتیلدون و ریشه طراحی شد. در هر سه آزمایش فاکتوریل، کال زایی با فاکتورهای محیط پایه (در دو سطحb5 و ms) و هورمون (در دو سطح 2,4-d mg/l 1 و2,4-d mg/l 5/0 mg/l ba 5 /0 +) در قالب طرح کاملاً تصادفی با 8 تکرار انجام گرفت و در نهایت کال های به دست آمده با استفاده از اگروباکتریوم حاوی سازه مورد نظر تلقیح شده و روی محیط گزینشگر برده شدند. آنالیز تجزیه واریانس و مقایسه میانگین بالاترین درصد کال زایی در محیط b5 را نشان داد. در مرحله جنین زایی نیز دو آزمایش فاکتوریل (با سه فاکتور محیط پایه، هورمون و کانامایسین) با 8 تکرار در قالب طرح کاملاً تصادفی اجرا شد. بیشترین جنین زایی و جوانه زنی جنین ها از کال های ریزنمونه هیپوکوتیل در محیط b5 تکمیل شده با 1 میلی گرم در لیتر 2,4-d و در سطح کانامایسن mg/l25 حاصل شد.